缓冲液如何确定离子柱纯化蛋白中常见的问题

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离子柱常见问题分析及解决方案

摘要：本文主要针对离子柱纯化蛋白中常见的问题进行分析，解释其原因并提出相应的解决方案。

缓冲液如何选择

用Tris-HCl还是PB，选择的依据是蛋白质的稳定性和活力在哪个缓冲液中好，浓度一般50mM，但是缓冲液应与样品缓冲液有相同的pH和离子强度。

洗脱采用的离子强度的大小范围应该如何确定

离子交换纯化是利用离子交换剂上的可解离基团(活性基团)对各种离子的亲和力不一样达到分离目的的一种蛋白纯化分离技术,离子强度越大，洗脱越好。具体的离子浓度范围可以很大，0.01mol/l到1mol/l，甚至3.0mol/l，PH值的范围液很广。主要根据你的蛋白质的等电点。

蛋白挂在阳离子交换柱上洗脱不下来蛋白与离子柱得结合太强，换弱阳的琼脂糖凝胶介质进行柱层析时应注意哪些问题，比如由sp的换成CM。减少离子柱与样品的结合时间，防止蛋白沉在柱上。若洗不下来的是杂蛋白直接用0.1M氢氧化钠洗。标签蛋白易洗脱离子交换每个梯度都洗下来目标蛋白，最大可能性是上样量过大，流速太大，建议增加清洗的体积数，减少上样量，降低上样速度。上样完洗脱前，清洗的不彻底。标签没有表达出来：填料有问题，换填料。PH、离子强度是否合适，平衡缓冲液是否应与样品缓冲液pH、离子强度相同。标签包涵体蛋白易洗脱蛋白质的折叠形态发生了改变隐藏了标签，而使得蛋白质无法挂柱。柱子没平衡好，平衡缓冲液没加咪唑，平衡液PH不适合，缓冲液pH要与蛋白质pI差1-2。有比邻的组氨酸的污染蛋白质与离子柱结合，通过降低洗脱液pH值使得标签质子化而使得污染蛋白质从层析住上被洗脱。一些蛋白质或DNA与带有标签的目的蛋白发生了非特异性相互作用，可以用低浓度的去污剂（2%的 X-100或浓度不大于0.5%SDS)洗涤样品（上样洗脱时）或增加洗脱液的盐浓度（氯化钠溶液低于2mol/L）。填料有问题，换填料。最后可以考虑一下试剂的问题。目的蛋白先洗脱杂蛋白被吸附更换缓冲液，可能pH与蛋白质pI较接近。填料选择不对，与蛋白结合力太弱，更换适合改纯化蛋白质的填料。直接收取目的蛋白，再用其他纯化方法进一步纯化。蛋白纯化出现沉淀pH发生变化，导致蛋白质沉淀。离子溶度过高，缓冲液的离子溶度降低。注意事项倒入速度不要太快进行柱层析时应注意哪些问题，以防产生泡沫和气泡。装柱的注意事项:应将洗脱液放至液面与树脂相切时再上样，且样品一旦加入就应该立即开始收集流出液。 （第一管，应在4ml处做一标记）。加样时要沿柱内壁缓慢地加入柱中，以免冲坏树脂表面，以及在柱内形成气泡，影响分离效果。20%乙醇保存柱子。

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